Бешенство — самая смертельная вирусная инфекция с почти 100% смертельным исходом. В настоящее время эффективного лечения не существует. Проблема бешенства в Казахстане остается нерешенной, постоянно регистрируются природные очаги заболевания, что требует повышения эффективности мер профилактики и борьбы с бешенством. Единственным методом лечения бешенства является использование специфической профилактики с помощью вакцин и антирабического иммуноглобулина (RIG). RIG получают из плазмы лошадей или людей. Оба продукта имеют несколько ограничений, связанных с безопасностью, поставками и стоимостью. Поэтому получение новых инновационных и дешевых средств борьбы с вирусом бешенства является актуальной задачей.

Цель проекта:

Разработка новых нанотел для эффективной нейтрализации вируса бешенства. Конструирование высокоспецифичного и чувствительного зонда на основе нанотел для быстрого обнаружения вируса бешенства в иммуноанализах.

 Задачи проекта:

1. Экспрессия G-белка вируса бешенства в виде правильно уложенного рекомбинантного белка и оценка антигенности продукта экспрессии.

2. Конструирование библиотеки кДНК-VHH (нанотела) методом фагового дисплея и селекция RABV-G-специфических нанотел.

3. Исследование эффективности нейтрализации RABV моно-, би- и трехвалентными RABV-специфичными нанотелами на мышах, зараженных летальной дозой RABV.

Полученные результаты:

Бешенство человека представляет серьезную угрозу для здоровья населения Казахстана, постоянно регистрируются природные очаги заболевания, что требует повышения эффективности мер профилактики и борьбы с бешенством. Этот проект направлен на создание новых нанотел для эффективной нейтрализации вируса бешенства, что имеет большой потенциал.

В данном проекте были выделены специфические наноантитела против вируса бешенства из сыворотки крови верблюдов при помощи методов обратной транскрипции и ПЦР. Созданы различные формы наноантител, способствующих эффективной нейтрализации вируса бешенства. Клонирован рекомбинантный гликопротеин (G-белок) вируса бешенства и экспрессирован в бактериальных и дрожжевых системах. Создано специфическое нанотело с щелочной фосфатазой, позволяющее ускорить процесс детекции вируса бешества в образцах методом иммуноферментного анализа с использованием одного этапа.

Таким образом, разработка специфических нанотел против вируса бешенства может привести к значительному снижению стоимости имеющихся вакцин, решить проблему снабжения отдаленных районов и имеет большие перспективы для дальнейшего коммерческого производства.

Цель проекта: Основная цель проекта - расшифровать и охарактеризовать на молекулярном уровне механизмы, вовлеченные в аберрантный путь BER, инициируемый мисматч-специфической тимин-ДНК гликозилазой в условиях in vitro и in vivo, и оценка физиологической роли аберрантного BER в накоплении спонтанных и индуцированных повреждением ДНК мутаций в живых клетках.

Задачи проекта:

 1. Подробная биохимическую характеристика монофункциональной ДНК-гликозилазы человека TDG, инициирующей аберрантный путь BER к ДНК-дуплексам, содержащим сложные повреждения ДНК in vitro.

2. Восстановление in vitro анализа аберрантной репарации ДНК с помощью очищенной ДНК-гликозилазы.

3. Характеристика клеточного ответы на генотоксический стресс штаммов S. cerevisiae и E. coli, сверхэкспрессирующих человеческую монофункциональную ДНК-гликозилазу TDG.

Полученные результаты:

 Синтезированы и очищены субстраты ДНК, содержащие окисленные основания, аристолактам-адениновые аддукты, экзоциклические аддукты ДНК и сшивки ДНК-ДНК. Сконструирована рекомбинантная плазмида с кДНК геном hTDG под контролем индуцибельного промотора бактериофага Т7, и с 6xHis•tag последовательностью на N–конце с применением генно-инженерных методов, что позволяет аффиной очистке белкового продукта на основе металл-хелатной хроматографии. Осуществлена функциональная экспрессия hTDG, в экспрессионном штамме E.coli Rosetta(DE3) и oчистка рекомбинантного белка hTDG с  6Х His-концом дo гoмoгeннoгo cocтoяния методом металл-хелатной хроматографии. Созданы каталитически неактивный TDG^N140A и гиперактивные TDG^A145G, и TDG ^H151Q формы hTDG методом сайт направленного мутагеназа. Замена ААЦ на ГЦА в нуклеотидной последовательности мутированной hTDG^N140A подтверждена методом секвенирования. Осуществлена функциональная экспрессия 6xHis-меченного hTDG N140A в экспрессионном штамме   Rosetta(DE3) и гомогенная очистка рекомбинантного инактивного белка hTDG N140A методом аффинной хромотографии. Осуществлена характеристика субстратной специфичности TDG человека в отношении олигонуклеотидных субстратов с окисленными основаниями, экзоциклическими аддуктами ДНК, аристолактам-адениновыми аддуктами. Проводятся работы по сравнению активности полноразмерной человеческой TDG и TDG cat и мутантов ее активного сайта в отношении олигонуклеотидных субстратов с окисленными основаниями, экзоциклическими аддуктами ДНК, аристолактам-адениновыми аддуктами и меж- и внутрицепочечными сшивками ДНК