Наименование проекта (согласно медиаплану). Новые антибактериальные препараты для лечения заболеваний осетровых рыб. 

Цель проекта. Исследование терапевтического потенциала родительских и конструированных химерных эндолизинов с повышенной литической активностью против грамотрицательных бактерий P. fluorescens, P. putida, A. hydrophila, A. salmonicida и A. sobria. Эти бактерии являются главными патогенами в аквакультуре осетровых, демонстрирующие повышенный уровень устойчивости к антибиотикам и вызывающие значительную заболеваемость и смертность у осетровых рыб. Цель предусматривает выполнение следующих задач: - выделение и физиологическая, биохимическая, молекулярная идентификация бактериальных патогенов P. putida, P. fluorescens, A. hydrophila, A. salmonicida и A. sobria из зараженных осетровых рыб; - конструирование химерных эндолизинов с повышенной литической активностью в отношении бактериальных патогенов, вызывающих заболевания осетровых рыб в аквакультуре; - характеристика антибактериальной активности in vitro и in vivo родительских и сконструированных новых химерных эндолизинов. 

НОУ-ХАУ. Выращивание осетровых в аквакультуре является одним из важных действий, направленных на решение проблемы сокращения популяции и восстановления почти прерванного жизненного цикла видов осетровых. Однако быстрое развитие аквакультуры сопровождается вспышками заболеваний, вызванных бактериальной инфекцией, которые приводят к высокой смертности и катастрофическим экономическим потерям в аквакультуре осетровых. Наиболее тяжелыми бактериальными заболеваниями у осетровых в аквакультуре являются инфекции, вызываемые с Pseudomonas и Aeromonas. В настоящее время из-за широкого и часто неконтролируемого использования антибиотиков количество бактерий, устойчивых к антибиотикам, резко возросло и является основной причиной заболеваемости и смертности. Это явление может не только привести к неудаче антимикробной терапии, но и вызвать опасения относительно безопасности рыбных продуктов. По этой причине срочно необходимы новые стратегии борьбы с этими лекарственно-устойчивыми патогенами.

В настоящее время эндолизиновая терапия считается очень перспективной альтернативой лечения сложных инфекций. За последние десять лет область исследований эндолизина значительно ускорилась. Некоторые эндолизины, разработанные различными компаниями, включая химерные эндолизины, в первую очередь против грамположительных и грамотрицательных патогенов человека и животных, в настоящее время находятся на стадии доклинических и клинических испытаний. Однако, потенциал эндолизинов в качестве антибактериальных агентов еще не изучен в области аквакультуры, хотя культивируемые рыбы, как и другие животные и люди, постоянно находятся под угрозой микробных атак.

Представленный проект направлен на разработку новых эффективных химерных эндолизинов с повышенной литической активностью в отношении грамотрицательных и устойчивых к антибиотикам бактерий, которые являются основной причиной заболеваний осетровых в аквакультуре. 

Актуальность и новизна. Производство осетровых в аквакультуре за последние годы значительно возросло из-за высокого спроса на икру на мировом рынке. Однако из-за широкого и часто неконтролируемого использования антибиотиков количество бактерий, устойчивых к антибиотикам, резко возросло и является основной причиной заболеваемости и смертности. Виды бактерий, чаще всего Aeromonas и Pseudomonas были зарегистрированы в качестве основных патогенов (рисунок 1).

Аэромоноз (А) и псевдомоноз осетровых рыб (В); Инфицированные осетровые рыбы из ТОО «Учебно-научный комплекс опытно-промышленного производства аквакультуры» (Уральск, Западно-Казахстанская обл.)

Рисунок 1 – Геморрагическая септицемия осетровых рыб

По этой причине срочно необходимы новые стратегии борьбы с этими лекарственно-устойчивыми патогенами. Эндолизины представляют собой возможные альтернативы антибиотикам. Эндолизины классифицируются в соответствии с ферментативной активностью в следующие три группы (рисунок 2А): (i) Гликозидазы, которые включают глюкозаминидазы (ЕС 3.2.1.52), мурамидазы (ЕС 3.2.1.17) и литические трансгликозилазы (ЕС 4.2.2.n1), действие этих ферментов направлены на расщепление β-(1,4)-гликозидные связи сахарного остова; (ii) амидазы (ЕС 3.5.1.28), которые гидролизуют амидную связь между главной цепью сахара и пептидными ветвями; и (iii) эндопептидазы (ЕС 3.4.-.-), которые гидролизуют связь между двумя аминокислотами. Структура эндолизинов может быть либо глобулярной, либо модульной (рисунок 2В).

A) 1 - Глюкозаминидазы; 2 - Мурамидазы (лизоцимы) и литические трансгликозилазы; 3 - L-аланин-амидазы; 4-эндопептидазы; GlcNac - N-ацетил глюкозамин; MurNac - N-ацетилмурамовая кислота. B) Схема структуры грам-положительных и грам- отрицательных эндолизинов.

Рисунок 2 - Структура пептидогликана и сайты расщепления гидролазами

Большинство эндолизинов фагов грамположительных бактерий имеют модульную структуру, состоящую из N-концевых каталитически активных доменов (CAD) и C-терминального связывающего клеточную стенку домена (CBD), отделенного коротким линкером.

Таким образом эндолизины способны эффективно и быстро вызывать гибель бактерии независимо от ее физиологического состояния или устойчивости к антибиотикам.  

Практическая значимость. Практическая значимость исследовательского проекта заключается в разработке новых эффективных химерных эндолизинов с повышенной литической активностью в отношении грамотрицательных и устойчивых к антибиотикам бактерий, которые являются основной причиной заболеваний в аквакультуре осетровых.  

Ожидаемые результаты: - будут выделены и идентифицированы бактериальные патогены (A. hydrophila, A. salmonicida, A. caviae, A. sobria, P. putida и P. fluorescens) осетровых рыб и проверена их чувствительность к антибиотикам в условиях in vitro;

- будут конструированы химерные эндолизины, а также клонированы гены трех родительских и 7 химерных эндолизинов и оптимизирована их экспрессия в E. coli;

- будет определена антибактериальная активнось эндолизинов, а также будут разработаны способы лечения инфицированных осетровых рыб. 

Объект внедрения. Объектом внедрения является антибактериальные препараты, применяемые для лечения заболеваний осетровых рыб вызванные бактериальными патогенами. 

Перспективы внедрения. В настоящее время эндолизиновая терапия считается очень перспективной альтернативой лечения сложных инфекций. Эндолизины являются ферментами, кодируемыми фагом, которые обладают пептидогликан гидролазной активностью и поэтому способны разрушать клеточную стенку бактерий, позволяя фагу покинуть клетку-хозяина после репликации. Полученые экспериментальные данные в условиях in vitro демонстрируют впечатляющую эффективность эндолизинов в лизисе бактериальных клеток, включая бактерии с множественной лекарственной устойчивостью (рисунок 3).

1 – контроль, 2 – эндолизин (25 мкг), 3 – эндолизин (50 мкг)

Рисунок 3 – Результаты антибактериальной активности эндолизина in vitro

В отличие от антибиотиков и бактериофагов, бактериальные штаммы не развивают устойчивость к эндолизинам, что способствует широкому применению антибактериальных препаратов.   

Потребители. Основными потребителями выступают рыбохозяйственные предприятия включая промышленные аквакультурные комплексы и рыбоводные заводы, а также фермеры-рыбоводы.

Конкурентоспособность (Преимущества технологии) и коммерциализация проекта. Результаты научно-исследовательского проекта коммерциализуемы так как имеют практическое значение в области ихтиопатологии и направлены на лечение и профилактику болезней рыб, выращиваемых в условиях регулируемых систем. В целом использование антибактериальных препаратов на основе лизирующих белков – эндолизинов не ограничивается применением только в лечении болезней рыб, также существует возможность использования в качестве профилактики бактериальных заболеваний и сельскохозяйственных животных, что делает предлагаемые препараты универсальными тем самым значительно увеличивает конкурентоспособность.